Биофизические исследования структуры и функции липидного слоя слезной жидкости и влияние эктоина. Часть В: Искусственные липидные пленки

мар 06, 2015

 

1_1_left

 

Содержание доступно в ScienceDirect

Biochimica et Biophysica Acta

Домашняя страница журнала: www.elsevier.com/locate/bbamem

1_1_right

Биофизические исследования структуры и функции липидного слоя слезной жидкости и влияние эктоина. Часть В: Искусственные липидные пленки

Mridula Dwivedi a, b, Mark Brinkkotter b, 1, Rakesh Kumar Harishchandra b, 1, 2, Hans-Joachim Galla b, *

a NRW International Graduate School of Chemistry and Institute of Biochemistry, Germany (Германия)

b Institute of Biochemistry, Westfälische Wilhelms Universität, Wilhelm-Klemm-Str. 2, 48149, Münster, Germany (Мюнхен, Германия)

АННОТАЦИЯ

Липидный слой слезной жидкости является внешней частью пленки слезной жидкости, устилающей глазную поверхность. Его функция заключается в том, чтобы поддерживать влажную поверхность роговицы, предотвращая испарение. Нестабильность в структуре липидного слоя слезной жидкости может привести к увеличению скорости испарения и, таким образом, к синдрому сухого глаза. Ранее было показано, что эктоин насыщает жидкостью липидные монослои и изменяет поведение фазы. В данном исследовании мы рассмотрели влияние эктоина на искусственный липидный слой слезной жидкости, который состоит из двойных и тройных липидных смесей дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПХП), холестериновых сложных эфиров и триацилглицеринов. Фокусом нашего изучения были структурные и биофизические аспекты искусственного липидного слоя слезной жидкости с применением исследований поверхностной активности и топологического анализа. Наличие эктоина последовательно вызывает расширение изотермы давления-площади, что свидетельствует о повышении межмолекулярного расстояния. Топологические данные показали формирование каплеобразных структур через добавление эктоина только тогда, когда триацилглицерин присутствует в смеси ДПХП и холестерина пальмитата, подобно природным мейбомиевым липидам. Следовательно, подтверждается гипотеза об исключении тридиацилглицерина из мейбомиевой липидной пленки при наличии эктоина в субфазе. В дальнейшем предложена модель, описывающая эффект эктоина на мейбомиевы липидные пленки, которая может применяться для использования эктоина в глазных каплях с целью лечения синдрома сухого глаза.

  1. Введение

Липидный слой является внешним слоем слезной пленки, образующей внешнюю прокладку глазной поверхности [1]. Этот слой снижает скорость испарения слезной жидкости, предотвращая высыхание эпителия роговицы [2]. Кроме того, он также принимает участие в поддержке прозрачной поверхности глаза [3] и действует в качестве защитного барьера против микробов и органических инородных частиц, таких как пыль и пыльца. Как было предложено Holly [1] в 1973 году, слезная пленка имеет двухслойную структуру: полярные липиды, формирующие нижний подслой, и неполярные липиды, образующие верхний подслой, находящийся в контакте с воздухом. Это положение получило дальнейшее развитие у Shine and McCulley [4]. Каждый подслой играет определенную роль в поддержке структурной целостности липидного слоя слезной жидкости. Нижний слой, содержащий полярные липиды, действует в качестве поверхностно-активного вещества, и расширение липидного слоя слезной жидкости становится термодинамически благоприятным. 

Предполагалось, что в состав нижнего слоя липидов входят полярные липиды, такие как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин (СM), церамиды и цереброзиды [5]. В последнее время было определено, что другая группа амфифилов, имеющих название (O-ацил)-ω-гидрокси-жирные кислоты, занимает важное место в подслое полярных липидов [6]. Верхний слой состоит из гидрофобных липидов, образующих покрытие и уплотнение основной водной части слезной жидкости. Следовательно, этот слой играет большую роль в предотвращении испарения слезной жидкости, поскольку липидные пленки имеют низкую проницаемость для паров воды в зависимости от толщины и состава. Считается, что липидный слой слезной жидкости состоит в основном из липидов, секретируемых в мейбомиевых железах. Чаще всего обнаруженные классы липидов в мейбомиевых железах являются общими восковыми эфирами (ВЭ) и холестериновыми сложными эфирами (ХСЭ) [6–8]. Однако состав общих слезных липидов отличается от секретов мейбомиевых желез. В основном эти отличия включают более высокое молярное отношение низкомолекулярных восковых эфиров – типичных видов в мейбомиевых железах человека [7–10]. Кроме того, было заявлено, что мейбомиевые липиды имеют более низкий порядок ациловой цепи, что приводит к более низкой температуре плавления, чем у липидов цельной слезы [11]. Но образцы цельной слезы показали спектроскопический сигнал органических групп фосфорной кислоты, которые содержатся в фосфатидилхолинах и сфингомиелине [12; 13]. Wollensak et al. [14] характеризовали липиды цельной слезы и показали, что ВЭ и ХСЭ составляют 45 % от общей массы липидов.

 

 

statyalipidb 


 

Рис. 1. Циклические изотермы сжатия-расширения для: ДПХП/ХП (9:1) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (а), ДПХП/ХП (9:1) на 100 мM эктоина (b), ДПХП/ДПОГ (9:1) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (с), ДПХП/ДПОГ (9:1) на 100 мM эктоина (d), ДПХП/ХП/ДПОГ (8:1:1) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (е), ДПХП/ХП/ДПОГ (8:1:1) на 100 мМ эктоина (f). Черная кривая – первый цикл. Красная кривая – второй цикл. Голубая кривая – третий цикл. Все измерения проводились при температуре 20° С

Свободные жирные кислоты (СЖК) и триацилглицериды (TAГ) составляют менее 15 %. Полярные липиды составляют 15 % от общей массы [14]. Кроме того, наличие полярных липидов в человеческих слезах было показано с помощью инфракрасной Фурье-спектроскопии [13]. Установлено, что состав липидного слоя слезной жидкости играет существенную роль в поддержке структурной целостности липидного слоя и любое изменение может привести к ряду глазных заболеваний.

Синдром сухого глаза (ССГ) – наиболее распространенное заболевание, которое сопровождается сухостью поверхности глаза и воспалением эпителия роговицы. Это, главным образом, становится причиной преждевременного разрыва пленки слезной жидкости, вследствие чего увеличивается скорость ее испарения. Изменение состава липидного слоя слезной жидкости тоже может нарушать структурную стабильность пленки, приводя к синдрому сухого глаза. McCulley et al. [15] показали, что разные формы синдрома сухого глаза вызваны дисфункцией мейбомиевых желез (ДМЖ). Уменьшенное производство липидов или липидов с более высокой температурой плавления может привести к неэффективному формированию липидного слоя и повышению скорости испарения. Изменение в липидной композиции у пациентов с синдромом сухого глаза и здоровых добровольцев было определено с использованием разных методов. Недавние исследования методом ядерно-магнитного резонанса показали композиционную разницу между пациентами с ДМЖ и здоровыми людьми [16]. Было выявлено, что мейбомиевы железы пациентов с ДМЖ имели более высокий липидный порядок, чем мейбомиевы железы здоровых лиц. Больший липидный порядок и температура фазового перехода также доведены в ИК-исследованиях с образцами мейбомиевых желез доноров с ДМЖ [17; 18].

statyalipidb2

Рис. 2. Циклические изотермы сжатия-расширения для ДПХП/ХП (7:3) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (а), ДПХП/ХП (7:3) на 100 мM эктоина (b), ДПХП/ДПОГ (7:3) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (с), ДПХП/ДПОГ (7:3) на 100 мM эктоина (d), ДПХП/ХП/ДПОГ (4:3:3) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора (е), ДПХП/ХП/ДПОГ (4:3:3) на 100 мМ эктоина (f). Черная кривая – первый цикл. Красная кривая – второй цикл. Голубая кривая – третий цикл. Все измерения проводились при температуре 20° С

 Кроме этого, было показано, что у пациентов с синдромом сухого глаза наблюдается сниженное отношение полярных липидов к нейтральным [19]. Увеличенное упорядочивание между ацильными цепями приводит к увеличению жесткости липидного слоя слезной жидкости. Снижение отношения полярных липидов к нейтральным также может стать причиной снижения эффективности поверхностно-активного вещества для поддержания структурной целостности и повышения жесткости. Таким образом, разумно предположить, что нестабильность слезной пленки может быть вызвана жестким липидным слоем с наличием повышенных уровней насыщения липидов и снижением отношения полярных липидов к нейтральным. Поэтому растворенные вещества, способные приводить к насыщению жидкостью липидных монослоев, являются потенциальными агентами для лечения ССГ. Ранее эктоин показал способность обогащать жидкостью липидные монослои in vitro, и, соответственно, он является одним из таких веществ.

Эктоины – низкомолекулярные органические растворенные вещества, которые синтезированы и выделены с помощью аэробных хемогетеротрофных и галофильных/галотолерантных бактерий при крайних стрессовых условиях, таких как высокая соленость, высокая температура и крайняя сухость [20]. Эти растворы не мешают обычному клеточному метаболизму даже при высоких концентрациях, отсюда и название – «совместимые растворенные вещества» [21]. Ранее было показано, что эктоины увеличивают интервал между главными группами липидов [22]. Механизм, с помощью которого эктоин вызывает такой эффект, все еще окончательно не изучен, однако некоторые исследования пытаются его моделировать [23]. В этом исследовании мы изучали влияние эктоина на биохимические и структурные характеристики искусственного липидного слоя слезной жидкости, состоящего из бинарных и тройных смесей дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПХП), холестеринового сложного эфира (ХСЭ) и триацилглицерина (ТАГ). Хотя основные липидные фосфолипиды, присутствующие в липидном слое слезной жидкости, являются ненасыщенными, мы выбрали ДПХП в связи с его хорошо изученным поведением фазы, а холестерин пальмитат и дипальмитоилолеоильный глицерид – в связи с их сравнительно длинными цепями по отношению к ДПХП.

 

 

ДПХП/ХП (9:1)

ДПХП/ХП (7:3)

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

10 мН/м

ectoin1ectoin2ectoin3ectoin4

 

 

ДПХП/ДПОГ (9:1)

ДПХП/ДПОГ (7:3)

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

10 мН/м

ectoin5ectoin6ectoin7ectoin8

 

 

ДПХП/ХП/ДПОГ (8:1:1)

ДПХП/ХП/ДПОГ (4:3:3)

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

Без ектоїну

10 мМ ектоїну

10 мН/м

ectoin9ectoin10ectoin11ectoin12

Рис. 3. Эпифлуоресцентные изображения для искусственного липидного слоя слезной жидкости, состоящего из ДПХП, ХП и ДПОГ. К липидной смеси добавляли 0,5 моль% BODIPY-РС, который преимущественно участвует в фазе жидкого расширения (ЖР). Изображения были сделаны путем сжатия и остановки барьера при необходимом поверхностном давлении. Все измерения проводились при температуре 20° C. Измерительная линейка составляет 50 мкм

Искусственная система была направлена на то, чтобы быть очень простой для изучения междулипидных взаимодействий, и не учитывает часть, включающую влияние белков в липидном слое слезной жидкости. Исследование поверхностной активности, морфология области и топографические исследования использовались для понимания влияния эктоина, и была выдвинута гипотеза для разъяснения механизма его действия.

 

  1. Материалы и методы

1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ) был приобретен у Avanti Polar Lipids Inc. (Альбастер, Алабама). Холестерил-3-пальмитат (ХП) и 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерол (ДПОГ) был приобретен у Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия). 2(4,4-дифтор-5-метил-4-бора-3а, 4а-диаза-S-индацен-3-додеканоил)-1-гексадеканоил-SN-глицеро-3-фосфохолин (SS-BODIPY®500/510C12-HPC, BODIPY-PC) был получен от Molecular Probes (Юджин, Орегон). Хлороформ и метанол были в стадии хроматографии под высоким давлением, приобретены у Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) и Merck (Дармштадт, Германия) соответственно. Эктоин ((S)-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота) был предоставлен Bitop AG (Уиттен, Германия). Вода была очищена и деионизирована с помощью мультикартриджной системы (Sartorius, Гетинген, Германия) и имела удельное сопротивление > 18 М Ω м.

 

2.1. Изотермы поверхностного давления-площади

 

Все исследования баланса пленки проводили на балансе аналитической пленки Вильгельми (Riegler and Kirstein, Майнц, Германия) с операционной площадью 144 см2. Все измерения поверхностного давления были сделаны на фосфатно-солевом буферном растворе при рН 7,4 в качестве буферной субфазы с и без эктоина при температуре 20° С. Липидная смесь состоит из ДПФХ, ХП и дипальмитоилолеоильного глицерина при разных композициях. Эти липидные смеси, растворенные в растворе хлороформа/метанола (1:1, об./об.), были распространены на субфазу. После уравновешивания в течение 10–15 минут монослои были сжаты со скоростью 2,9 см2/мин.

  • . Видеоулучшенная эпифлуоресцентная микроскопия

В доменные структуры липидных смесей добавляли 0,5 моль% BODIPY-PC и визуализировали их с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Olympus STM5-MJS, Olympus, Гамбург, Германия), который имел двухкоординатную платформу и был подсоединен к CCD-камере (Hamamatsu, Хершинг, Германия). Изображения были получены путем остановки барьера при желаемом поверхностном давлении.


statyalipidb4

Рис. 4. АСМ-изображение для ДПФХ/ХП (9:1) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

 

2.3. Атомно-силовая микроскопия

Изображение атомно-силовой микроскопии (АСМ) пленок Ленгмюра-Блоджетта (ЛБ) переносили на листовой меканит [24] в условиях окружающей среды (20° С) и сканировали с помощью NanoWizard III (JPK Instruments, Берлин, Германия). Были использованы наконечники из нитрида кремния (бюджет-датчики, София, Болгария) с динамической жесткостью 40 Н/м и резонансной частотой 300 ± 100 кГц. В данном исследовании был использован режим прерывистого контакта. Изображения получены при разрешении 512х512 пикселей и проанализированы программным обеспечением. Сканы жесткости получены путем визуализации в количественном режиме с использованием той же консоли, что и для топографического сканирования.

 

  1. Результаты

В этом исследовании для изучения влияния эктоина на искусственный липидный слой слезной жидкости и ее отдельные компоненты мы использовали различные комбинации из фосфолипидов (ДПФХ), холестеринового сложного эфира холестерин-пальмитата (ХП) и триацилглицерина дипальмитоилолеоилглицерина (ДПОГ). Изучение поверхностной активности различных липидных смесей c наличием и при отсутствии эктоина проводилось на балансе пленки Ленгмюра. Топографические исследования выполнялись с помощью атомно-силовой микроскопии, для создания модели природного липидного слоя слезной жидкости проанализированы высотные структуры. Наконец, сравнивая данные природного и искусственного липидного слоя мейбомиевых желез, мы представляем модель наблюдаемого влияния эктоинов на липидную пленку.

 

3.1. Исследование поверхностной активности

 

Как видно из рис. 1 и 2, изотермы ДПФХ/ХП (9:1), ДПФХ/ХП (7:3) и ДПФХ/ДПОГ (9:1) очень похожи на изотермы чистого ДПФХ [25] с областью сосуществования фазового перехода при давлении на поверхности 4–7 мН/м. При наличии 100 мМ эктоина изотермы расширяются в сторону увеличения площади доступной поверхности и область сосуществования фаз уменьшается. Это значит, что площадь, занимаемая главными группами липидов, увеличивается. Увеличенный наклон жидкой конденсированной области подразумевает ослабление взаимодействия между межфазными липидными молекулами. Беспрерывные циклы сжатия-расширения не показывают значительных последствий влияния эктоина на гистерезис. Изотерма ДПФХ/ДПОГ (7:3) резко отличается от чистого ДПФХ, указывая на огромную структурную реорганизацию в связи с добавлением заданной концентрации неполярных липидов, таких как триацилглицерол (см. рис. 2). Наличие эктоина в субфазе вызывает расширение изотермы к более высокой площади доступной поверхности, как уже ранее отмечалось в других липидных смесях (см. рис. 2, b, d, f).


statyalipidb5

Рис. 5. АСМ-сканы для ДПФХ/ХП (7:3) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

 При наличии эктоина расширение изотерм в сторону более высокой площади доступной поверхности последовательно наблюдается в разных липидных смесях. Это указывает на то, что исследуемая площадь, занимаемая главными группами липидов, во всех случаях увеличивается в присутствии эктоина. Похожие эффекты эктоина наблюдались с природными мейбомиевыми липидами.

  • . Исследования методом эпифлуоресцентной микроскопии

Эффект эктоина на свойства липидного монослоя, такие как разделение фаз и морфология домена, был изучен с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Липидный монослой формирует фазу, которая отделяет домены при сжатии в зависимости от температуры поверхности. Морфология домена изучается с использованием эпифлуоресцентной микроскопии путем добавления липидного монослоя с окрашиванием BODIPY-PC, который, как известно, участвует преимущественно в фазе жидкостного расширения (ФЖР). Таким образом, жидкостная конденсированная фаза (ЖКФ) появляется как темный домен.

Флуоресцентные изображения для разных липидных смесей с наличием и при отсутствии эктоина показаны на рис. 3. Для удобства читателей здесь приведены только данные при давлении на поверхности 10 мН/м. Для смеси ДПФХ/ХП (7:3) более темные домены (или жидкостная конденсированная фаза) выглядят в основном как очень тонкие фибриллы, которые видны при максимально близком рассмотрении. С добавлением эктоина размер фибрилл увеличивается, и они становятся менее плотными. Для смеси ДПФХ/ХП (7:3) мелкие волокна, похоже, выходят из темных доменов, которые могут быть идентифицированы как центр зарождения. При наличии эктоина более темные домены имеют меньший размер, а размер фибрилл увеличивается. Поскольку более темные домены появляются при более высоких концентрациях ХП, мы предполагаем, что эти домены в основном обогащены ХП. Аналогичный эффект эктоина наблюдается для смесей ДПФХ/ДПОГ. В этих смесях (9:1) мы наблюдаем большие домены жидкостной конденсированной фазы, которые уменьшаются в размерах в присутствии эктоина. Кроме того, для смесей ДПФХ/ДПОГ (7:3) жидкостные конденсированные домены, возникающие при поверхностном давлении 10 мН/м, уменьшаются в присутствии 100 мМ эктоина. Для тройных смесей, т. е. ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1) и ДПФХ/ХП/ДПОГ (4:3:3), размер жидкостных конденсированных доменов уменьшается. Следовательно, при добавлении эктоина увеличивается плотность, что согласовывается с тем, что ранее наблюдалось для липидных смесей.

Равновесные формы и размеры изотропных сосуществующих жидкостных фаз в монослое были объяснены с использованием в основном двух конкурирующих факторов: а) линейное напряжение, присутствующее между соседними доменами (λ); б) разница в дипольной концентрации в этих фазах (µ) [26–28]. Линейное напряжение возникает в связи с гидрофобным несоответствием между сосуществующими фазами, что способствует образованию больших круговых доменов. Разница в дипольной концентрации или большой диапазон диполярных сил способствуют образованию мелких некруговых доменов. Эти силы конкурируют между собой в определении формы и размера доменов, основанных на соотношении λ/µ2, которое пропорционально Req равновесному радиусу. Если фактический радиус доменов меньше, чем Req, образовываются круговые домены, а в случае, когда он больше Req, образовываются некруговые расширенные домены. С увеличением температуры на поверхности это соотношение уменьшается, формируя большие некруговые домены. Как мы наблюдали в разных липидных смесях, размер домена уменьшается с добавлением эктоина. Кроме того, домены являются более круговыми, а это предусматривает увеличение значения Req, что может быть следствием снижения µ или увеличения λ. Формирование малых доменов подспудно указывает на уменьшение значения µ, разницы дипольной концентрации, а эта величина, как упоминалось ранее, зависит от многих факторов.

 

statyalipidb6

Рис. 6. АСМ-сканы для ДПФХ/ДПОГ (9:1) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

Одним из факторов является плотность расположения липидов, которая, как ожидается, уменьшается с добавлением эктоина. Мы предполагаем, что такое уменьшение плотности расположения липидов отвечает за уменьшение разницы дипольной концентрации, которое приводит к образованию более мелких доменов. Кроме того, вполне возможно, что присутствие эктоина влияет и на линейную напряженность, как и на разницу дипольной концентрации; однако эффект на последнюю более заметен.

  • Топографические исследования

Структурная организация разных липидных молекул в липидных смесях с и без эктоина проанализирована при различных сжатых состояниях с помощью атомно-силовой микроскопии. АСМ-сканы ДПФХ/ХП (9:1) на субфазе фосфатно-солевого буферного раствора при низком давлении показывают присутствие двух фаз с 0,36 ± 0,16 нм перепадом высот (см. рис. 4). В присутствии эктоина размер домена уменьшается и появляются три разные фазы с разницами высот 0,73 ± 0,23 нм (см. рис. 4, b). При высоком давлении мы наблюдали упорядоченные пунктирные структуры высотой 4,96 ± 0,33 нм (см. рис. 4, c). В присутствии эктоина пунктирные структуры (с высотой 4,85 ± 0,5 нм) меньше по размеру и более рассредоточены, что предполагает в дальнейшем уменьшение разницы дипольной концентрации между разными фазами (см. рис. 4, d). Исследование моделирования для ХП/ХСЭ (9:1) [29], как уже упоминалось в части А этого исследования (Dwivedi et al., 2014, в печати), показывают, что при низком давлении молекулы холестеринового сложного эфира расположены между молекулами ХП, и эфирная связь направлена к водной фазе. При более высоком давлении эфирная связь СХЭ переворачивается вверх и молекулы ХП исключаются из водно-ориентированного липидного граничного слоя, чтобы создать воздухо-ориентированный липидный граничный слой. Это согласуется с нашими наблюдениями в АСМ-исследованиях, где при низком давлении регистрируются домены разделенной фазы с высотой всего 0,36 ± 0,16 нм. Однако при более высоком давлении появляются плоские структуры высотой 4,96 ± 0,33 нм, которые могут быть представлены холестериновыми сложными эфирами, исключенными из ХП-монослоя, чтобы сформировать гребенчатые стеки. Гребенчатые холестериновые сложные эфиры будут вызывать другую фазу в межфазном ХП-монослое. На эту фазу также влияет наличие эктоина. Отношение линейной напряженности и разницы дипольной концентрации между фазами изменяется, что влияет на размер домена.

Для ДПФХ/ХП (7:3) АСМ-сканы при низком давлении показывают наличие плоских структур высотой 4,47 ± 1,03 нм, которые больше по размеру, чем структуры, наблюдаемые ранее, – с 10 моль% холестериновыми сложными эфирами (см. рис. 5, а). Этим подтверждается предыдущее предположение, что наблюдаемые структуры высотой 4,96 ± 0,33 нм в основном состоят из холестериновых сложных эфиров и, вероятно, из гребенчатых многослойных стеков. Повышенная концентрация холестериновых сложных эфиров, возможно, приводит к их изоляции при низких давлениях, в отличие от 10 моль% холестериновых сложных эфиров. При высоком давлении АСМ-изображения соответствуют эпифлуоресцентным, на которых мы наблюдали жидкостные конденсированные домены вместе с волокнами, выходящими из них. АСМ-сканы показывают структуры домена высотой 4,92 ± 0,33 нм, окруженные выровненными пунктирными структурами (см. рис. 5, с), которые, как считается, являются искаженными фибриллами, как видно на эпифлуоресцентных изображениях. В присутствии эктоина домены становятся более круглыми и сравнительно меньшими по размеру (см. рис. 5, b, d). Это похоже на предыдущие наблюдения микроскопических исследований эпифлуоресценции, где уменьшение размера домена было подтверждено повышением соотношения λ/µ2. Этим снова демонстрируется уменьшение порядка расположения липидных молекул в липидной пленке в связи с наличием эктоина.

АСМ-сканы смесей ДПФХ/ДПОГ (9:1) при низком давлении показывают фазовые домены с высотой 0,56 ± 0,07 нм (см. рис. 6, а). Достаточно трудно предсказать основное содержание этих доменов, поскольку площадь доступной поверхности является высокой, а агрегация молекул ДПОГ еще не может ожидаться. При высоком давлении наблюдаются высококомпактные фазовые домены с перепадом высот 0,315 ± 0,06 нм (см. рис. 6, с). Ожидается, что ДПОГ будут обогащены в более толстых областях, поскольку они, наиболее вероятно, являются гидрофобными.

statyalipidb7 

Рис. 7. АСМ-сканы для ДПФХ/ДПОГ (7:3) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

 С добавлением эктоина при низком и высоком давлении мы видим формирование каплеобразных структур (см. рис. 6, b, d), аналогичных тем, которые наблюдаются с природными мейбомиевыми липидами (Dwivedi et al., 2014, в печати). Высота этих каплеобразных структур колебалась в диапазоне от 70 нм до 600 нм.

АСМ-сканы смесей ДПФХ/ДПОГ (7:3) показывают обособленные фазовые домены с высотой приблизительно 1,5 ± 0,36 нм (см. рис. 7, а). В связи с высокой концентрацией ДПОГ и, следовательно, низкой растворимостью ДПОГ в монослое ДПФХ, возможно, что молекулы ДПОГ исключены из монослоя ДПФХ для формирования этих обособленных фазовых доменов. В присутствии эктоина мы последовательно наблюдали возникновение каплеобразных структур (см. рис. 7, b). При высоком поверхностном давлении АСМ-сканы смесей ДПФХ/ДПОГ (7:3) показывают компактно расположенные домены с различиями высоты около 0,34 ± 0,06 нм (см. рис. 7, c). Наряду с этим, мы находим структуры с высотой 2–3 нм между доменами. Эти структуры, как мы ожидаем, есть молекулами ДПОГ, агрегированными вследствие его низкой растворимости в монослое ДПФХ. В присутствии эктоина мы снова находим каплеобразные структуры, имеющие высоту несколько сотен нанометров (см. рис. 7, d). Стоит отметить, что такое образование каплеобразных структур не доказано для смесей ДПФХ/ХП. Это значит, что более гидрофобные компоненты, такие как ДПОГ, преимущественно исключаются из монослоя ДПФХ в присутствии эктоина, образуя таким образом каплеобразные структуры.

АСМ-сканы для ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1) при низком давлении показывают обособленные фазовые домены с высотой 0,6 ± 0,12 нм вдоль плоских структур с высотой 5 нм (см. рис. 8). При высоком давлении плоские структуры высотой 5,15 ± 0,17 нм являются более четкими, что предполагает организованное молекулярное расположение (см. рис. 8, с). Эти структуры с высотой 5,15 ± 0,17 нм аналогичны тем, которые ранее наблюдались в смесях ДПФХ/ХП, и, возможно, образуются в результате интеркаляции молекул ХП в монослое ДПФХ. Можно предположить, что эта интеркаляция молекул является многослойной структурой высотой около 5 нм. При наличии 100 мМ эктоина мы снова наблюдали образование каплеобразных структур (см. рис. 8, b, d). Как и ранее с различными смесями ДПФХ, ХП и ДПОГ, мы видим, что более гидрофобный компонент с высшей вероятностью будет исключен из монослоя ДПФХ. Отсюда делаем вывод, что каплеобразные структуры в основном состоят из более гидрофобного компонента, которым в этом случае является ДПОГ.

Для липидной смеси ДПФХ/ХП/ДПОГ (4:3:3) АСМ-сканы при низком давлении показывают хорошо организованные разветвленные домены с высотой до 1,704 ± 0,2 нм (см. рис. 9, а). Наряду с этим, мы наблюдаем обособленные фазовые домены высотой 0,5 нм. При высоком давлении видим плоские структуры высотой 5,25 ± 0,26 нм, как ранее наблюдалось в ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1) (см. рис. 9, c). Как уже говорилось ранее, мы считаем, что эти структуры являются молекулами ХП, образующими организованные многослойные структуры. С добавлением эктоина наблюдаем каплеобразные структуры высотой несколько сотен нанометров, распределенные по всей поверхности при низком и высоком давлении (см. рис. 9, b, d). Кроме того, также видны структуры высотой 5 нм.

Для более глубокого понимания физических характеристик каплеобразных структур, полученных в присутствии эктоина, проводились сканы жесткости. Кривые силы, полученные с помощью АСМ, можно использовать для расчета жесткости образца в определенных точках. Кроме того, режим количественной визуализации расширяет сферу, обеспечивая измерение силы сканирования во всех точках в области сканирования. Для анализа характеристик каплеобразных структур, полученных в присутствии эктоина, мы провели сканирование жесткости. Топологические сканы и сканы соответствующей жесткости для каплеобразных структур, полученные в пленке ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1), представлены на рис. 10. Каплеобразные структуры более темные по сравнению с окружающими областями сканирования, что указывает на их нежесткую природу. Значит, они состоят из менее жестких компонентов, которые похожи на сканы жесткости для природных мейбомиевых липидов в присутствии эктоина (часть А данного исследования (Dwivedi et al., 2014, в печати)).

statyalipidb8

Рис. 8. АСМ-сканы для ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

  1. Обсуждение

В части А данного исследования (Dwivedi et al., 2014, в печати) эффект эктоина изучали на мейбомиевом липидном слое с помощью исследований поверхностной активности и топографических исследований. Кроме того, изучались структурные аспекты липидного слоя слезной жидкости, включающей мейбомиевые липиды в разных сжатых состояниях. Было обнаружено, что при низких давлениях возникают полиморфные структуры, которые количественно увеличиваются при дальнейшем сжатии. Предположили, что они являются гидрофобными компонентами мейбомиевого липидного слоя, исключенными из липидной пленки при компрессии. Кроме того, при состояниях более высокого сжатия на плоскости липидного слоя происходит реверсивный фолдинг и увеличение поверхностного давления становится постепенным. В присутствии эктоина изотермы поверхностного давления-площади показывают увеличение межмолекулярного расстояния, что вызывает эффект «насыщения жидкостью». Топографические исследования показали появление каплеобразных структур при всех сжатых состояниях. Предполагалось, что каплеобразные структуры включают в себя в основном гидрофобные компоненты, которые исключены из пленки в связи с увеличением межмолекулярного расстояния в самом нижнем полярном липидном слое и, следовательно, уменьшают гидрофобность пленки.

Для подтверждения гипотезы, установленной в части А данной работы (Dwivedi et al., 2014, в печати), по отношению к структурной организации липидного слоя слезной жидкости и влиянию эктоина на его различные компоненты, изучались искусственные липидные слои слезной жидкости, состоящей из двойных и тройных смесей липидов. Наличие эктоина в субфазе, соответственно, приводит к расширению изотермы поверхностного давления-площади для разных смесей ДПФХ, ХП и ДПОГ-смесей в сторону увеличения площади доступной поверхности, как ранее наблюдалось и с природными мейбомиевыми липидами. В исследованиях искусственных липидных слоев слезной жидкости методом эпифлуоресцентной микроскопии было показано, что размер жидкостного конденсированного домена уменьшается, и он становится более округлым при добавлении эктоина. Это соответствует исследованиям поверхностной активности, подтверждающим наблюдения касательно того, что порядок межфазного расположения липидов уменьшается в присутствии эктоина. Также топографические сканы смесей ДПФХ/ХП показывают уменьшение размера домена, подтверждая снижение порядка расположения липидов согласно исследованиям поверхностной активности и данным эпифлуоресцентной микроскопии. Топографические сканы смесей ДПФХ/ХП показывают плоские структуры высотой 5 нм, которые, вероятно, есть молекулами ХП, плотно замкнутыми между полярными липидами. Высота 5 нм позволяет предположить, что эти структуры могут быть мультисложенными, формирующими при этом плоские структуры. Наличие эктоина в субфазе вызывает изменение в морфологии домена, как уже упоминалось ранее. Тем не менее, топографические сканы липидных смесей с ДПОГ последовательно показывают наличие каплеобразных структур в присутствии эктоина. Это свидетельствует о том, что гидрофобные компоненты, такие как ДПОГ, преимущественно исключены из липидной пленки в присутствии эктоина (см. рис. 11). Кроме того, количественная визуализация позволила нам выделить физические свойства каплеобразных структур из окружающей области региона сканирования. Может быть доказано, что эти каплеобразные структуры действительно состоят из более мягких нежестких компонентов липидного слоя.

Структуру липидных слоев слезной жидкости пытались объяснить, проводя многочисленные исследования с использованием различных методов. Сейчас мы достигли базового понимания того, что пленка является многослойной структурой. Считается, что полярные липиды формируют поверхностно-активный слой; холестериновые сложные эфиры и другие гидрофобные компоненты предположительно образуют верхний слой, который служит для предотвращения испарения.

 

statyalipidb9

Рис. 9. АСМ-сканы ДПФХ/ХП/ДПОГ (4:3:3) при поверхностном давлении 6 мН/м (a, b) и 45 мН/м (c, d), перенесенных из фосфатно-солевого буферного раствора с и без эктоина. Все измерения проводились при температуре 20° C

Важная роль холестериновых сложных эфиров в установлении структуры липидного слоя слезной жидкости была признана многими исследованиями, идея которых основана на том, что ХСЭ имеют тенденцию к образованию кристаллических структур на поверхности пленки. Недавние исследования, проведенные Miial and King-Smith [30], свидетельствуют в пользу модели двухстороннего характера мейбомиевой липидной пленки, как впервые было предложено Holly [1] и в дальнейшем доработано McCulley and Shine [4].

По нашим наблюдениям и согласно предыдущим данным, выясняющим структурные аспекты липидного слоя слезной жидкости, мы принимаем модель, показанную на рис. 11, для формирования понимания того, как влияет эктоин на молекулярную организацию липидного слоя слезной жидкости. Полярные липиды, как ранее было установлено, образуют водно-липидный граничный слой, который отвечает преимущественно за расширение свойств липидной пленки. Стериновые сложные эфиры и структурно подобные липиды внедряются в полярный липидный слой из воздухо-ориентированных ацильных цепей, образовывая многослойные стеки нейтральных липидов, из которых формируется гидрофобная платформа, вмещающая основную часть гидрофобных компонентов липидной пленки, например, триацилглицериды. Эти гидрофобные компоненты формируют воздухо-ориентированную липидную границу и имеют крайне важное значение для снижения скорости испарения слезной жидкости. Уменьшение соотношения полярных липидов к нейтральным вызывает конденсирование межфазных полярных липидов, делая пленку сравнительно жесткой и, следовательно, более восприимчивой к разрыву. Следует отметить, что это очень упрощенная модель, направленная лишь на понимание межлипидных взаимодействий. Она не учитывает роль белков в поддержании биофизической функции липидного слоя. При наличии эктоина межфазная полярная плотность расположения липидов уменьшается, что приводит к снижению жесткости пленки. При наличии высокой концентрации эктоина (100 мМ) уменьшенная плотность расположения липидов уменьшает гидрофобную платформу, доступную для гидрофобных липидов. Следовательно, это приводит к агрегации гидрофобных компонентов, таких как триацилглицериды, для формирования липидных капель на липидной пленке.

statyalipidb10

Рис. 10. АСМ-сканы липидной пленки ДПФХ/ХП/ДПОГ (8:1:1) в присутствии 100 мМ эктоина в субфазе. Топологические сканы (a), сканы соответствующей жесткости (b). Сканы жесткости показывают, что каплеобразные структуры являются более темными по сравнению с окружением, что указывает на их нежесткую природу. Все измерения проводились при температуре 20° C

Следует отметить, что каплеобразные структуры наблюдаются только при высоких концентрациях эктоина, в то время как при низких концентрациях всего лишь изменяются изотермы в сторону большей площади доступной поверхности. Это указывает на то, что формирование каплеобразных структур является предельным эффектом насыщения жидкостью пленки, вызванным эктоином. Таким образом, при соответствующих дозах (в форме глазных капель) можно использовать этот эффект насыщения жидкостью для предупреждения синдрома сухого глаза.

 

  1. Выводы

Было показано, что наличие эктоина приводит к насыщению жидкостью мейбомиевой липидной пленки. В этом исследовании эффект эктоина изучали на искусственном липидном слое слезной жидкости, используя исследования поверхностной активности, морфологии домена и атомно-силовую микроскопию. Наличие эктоина последовательно приводило к увеличению изотермы поверхностного давления-площади, что подразумевает повышенную насыщенность жидкостью. Топологические сканы указывают на формирование каплеобразных структур при наличии эктоина только тогда, когда неполярный компонент (в данном случае триацилглицерин) присутствовал с ДПФХ и ХСЭ. Этот результат идентичен полученному для мейбомиевых липидов. Таким образом, была подтверждена гипотеза, что эти каплеобразные структуры состоят из гидрофобного компонента липидной пленки. На основе таких наблюдений был сделан вывод о том, что присутствие эктоина в субфазе вызывает увеличение межмолекулярного расстояния и, следовательно, снижает гидрофобность пленки. Это, в свою очередь, приводит к изгнанию гидрофобного компонента из каплеобразных структур. Кроме того, на основании эффекта насыщения жидкостью эктоин был предложен для применения в лечении синдрома сухого глаза.


 

 statyalipidb11

Рис. 11. Молекулярная модель, объясняющая эффект высокой концентрации эктоина на липидный слой слезной жидкости (а). Макроскопическая модель, объясняющая эффект высокой концентрации эктоина на липидный слой слезной жидкости (b)

 Благодарность

Эта работа финансируется NRW International Graduate School of Chemistry путем предоставления кандидатского гранта MD. Мы признаем и ценим сотрудничество с Bitop GmbH, Witten, а также поддержку нашего проекта от Ursapharm Arzneimittel GmbH, Saarbrücken. Особенно мы благодарны за ценные обсуждения доктору Бильштайну из Bitop AG.

Литература

  1. J. Holly, Formation and rupture of tear film, Exp. Eye Res. 15 (1973) 515–525.
  2. P. Craig, A. Tomlinson, Importance of the lipid layer in human tear film stability and evaporation, Optom. Vis. Sci. 74 (1997) 8–13.
  3. N. Thibos, X. Hong, A. Bradley, C. Begley, Deterioration of retinal image quality due to breakup of the corneal tear film, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (1999) 544.
  4. P. McCulley, W. E. Shine, The lipid layer: the outer surface of the ocular surface tear film, Biosci. Rep. 21 (2001) 407–418.
  5. E. Shine, J. R. McCulley, Polar lipids in human meibomian gland secretions, Curr. Eye Res. 26 (2003) 89–94.
  6. A. Butovich, J. C. Wojtowicz, M. Molai, Human tear film and meibum. Very long chain wax esters and (O-acyl)-omega-hydroxy fatty acids of meibum, J. Lipid Res. 50 (2009) 2471–2485.
  7. A. Butovich, E. Uchiyama, J. P. McCulley, Lipids of human meibum: mass-spectrometric analysis and structural elucidation, J. Lipid Res. 48 (2007) 2220–2235.
  8. A. Butovich, E. Uchiyama, M. A. Di Pascuale, J. P. McCulley, Liquid chromatography-mass spectrometric analysis of lipids present in human meibomian gland secretions, Lipids 42 (2007) 765–776.
  9. D. Sullivan, J. E. Evans, M. R. Dana, D. A. Sullivan, Impact of androgen deficiency on the lipid profiles in human meibomian gland secretions, Adv. Exp. Med. Biol. 506 (2002) 449–458.
  10. D. Sullivan, J. E. Evans, M. R. Dana, D. A. Sullivan, Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions, Arch. Ophthalmol. Chic. 124 (2006) 1286–1292.
  11. N. Foulks, D. Borchman, M. Yappert, S. H. Kim, J. W. McKay, Topical azithromycin therapy for meibomian gland dysfunction: clinical response and lipid alterations, Cornea 29 (2010) 781–788.
  12. Borchman, G. N. Foulks, M. C. Yappert, D. V. Ho, Temperature-induced conformational changes in human tear lipids hydrocarbon chains, Biopolymers 87 (2007) 124–133.
  13. Borchman, G. N. Foulks, M. C. Yappert, D. X. Tang, D. V. Ho, Spectroscopic evaluation of human tear lipids, Chem. Phys. Lipids 147 (2007) 87–102.
  14. Wollensak, E. Mur, A. Mayr, G. Baier, W. Gottinger, G. Stoffler, Effective methods for the investigation of human tear film proteins and lipids, Graefes Arch. Clin. Exp. 228 (1990) 78–82.
  15. P. McCulley, W. E. Shine, Meibomian gland and tear film lipids: structure, function and control, Adv. Exp. Med. Biol. 506 (2002) 373–378.
  16. Borchman, G. N. Foulks, M. C. Yappert, S. E. Milliner, Differences in human meibum lipid composition with meibomian gland dysfunction using NMR and principal component analysis, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (2012) 337–347.
  17. N. Foulks, D. Borchman, Meibomian gland dysfunction: the past, present, and future, Eye Contact Lens 36 (2010) 249–253.
  18. Borchman, G. N. Foulks, M. C. Yappert, J. Bell, E. Wells, S. Neravetla, V. Greenstone, Human meibum lipid conformation and thermodynamic changes with meibomian-gland dysfunction, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2011) 3805–3817.
  19. E. Shine, J. P. McCulley, Meibomian gland secretion polar lipids associated with chronic blepharitis disease groups, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 37 (1996) 3926.
  20. A. Galinski, H. P. Pfeiffer, H. G. Truper, 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine-carboxylic acid – a novel cyclic amino-acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira, Eur. J. Biochem. 149 (1985) 135–139.
  21. K. Lippert, E. A. Galinski, Enzyme stabilization by ectoine-type compatible solutes – protection against heating, freezing and drying, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 (1992) 61–65.
  22. R. K. Harishchandra, A. K. Sachan, A. Kerth, G. Lentzen, T. Neuhaus, H. J. Galla, Compatible solutes: ectoine and hydroxyectoine improve functional nanostructures in artificial lung surfactants, Biochim. Biophys. Acta 1808 (2011) 2830–2840.
  23. J. Smiatek, R. K. Harishchandra, O. Rubner, H. J. Galla, A. Heuer, Properties of compatible solutes in aqueous solution, Biophys. Chem. 160 (2012) 62–68.
  24. S. Krol, M. Ross, M. Sieber, S. Kunneke, H. J. Galla, A. Janshoff, Formation of threedimensional protein-lipid aggregates in monolayer films induced by surfactant protein B, Biophys. J. 79 (2000) 904–918.
  25. C. W. McConlogue, T. K. Vanderlick, A close look at domain formation in DPPC monolayers, Langmuir 13 (1997) 7158–7164.
  26. D. J. Benvegnu, H. M. Mcconnell, Line tension between liquid domains in lipid monolayers, J. Phys. Chem. 96 (1992) 6820–6824.
  27. D. J. Benvegnu, H. M. Mcconnell, Surface dipole densities in lipid monolayers, J. Phys. Chem. 97 (1993) 6686–6691.
  28. H. M. McConnell, Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water interface, Annu. Rev. Phys. Chem. 42 (1991) 171–195.
  29. J. Telenius, A. Koivuniemi, P. Kulovesi, J. M. Holopainen, I. Vattulainen, Role of neutral lipids in tear fluid lipid layer: coarse-grained simulation study, Langmuir 28 (2012) 17092–17100.
  30. T. J. Millar, P.E. King-Smith, Analysis of comparison of human meibomian lipid films and mixtures with cholesteryl esters in vitro films using high resolution color microscopy, Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (2012) 4710–4719.

 

 

 

 

похожие статьи:

ПОВРЕЖДЕНИЕ КОНЪЮНКТИВЫ: ЛЕЧЕНИЕ, ПРОФИЛАКТИКА

Сентябрь 09, 2015

Повреждения конъюнктивы: лечение и профилактика Повреждение конъюнктивы – одно из самых частых поражений глаз, требующее скорейшего медицинского вмешательства. Конъюнктива...

Европейская разработка уже в Украине

Май 13, 2015

В 2015 г. на украинском рынке появились новые средства для лечения и профилактики симптомов аллергического конъюнктивита, а также терапии синдрома сухого глаза – EYE-t® Ektoin...

глазные капли

EYE-t Эктоин

Содержит 0,5% эктоина

— Капли с эктоином
Подробнее

противоаллергенные глазные капли

EYE-t Эктоин Про

Содержит 2% эктоина

— Противоаллергенные
Подробнее